Оценка уровней цитокинов в сыворотке и роли лечения каннабидиолом в модели астмы на животных

Оценка уровней цитокинов в сыворотке и роли лечения каннабидиолом в модели астмы на животных

Image
Купить КБД

Влияние каннабидиола на воспалительные процессы астмы

Астма представляет собой проблему общественного здравоохранения и традиционно классифицируется как атопическое заболевание, при котором аллерген может вызывать клиническое воспаление дыхательных путей, гиперчувствительность бронхов и обратимую обструкцию дыхательных путей. Исследования показали наличие T-хелперов 2-лимфоцитов в легких у пациентов с астмой. Эти клетки участвуют в выработке цитокинов, которые регулируют синтез иммуноглобулинов. Признавая, что взаимодействие Т-клеток с антигенами / аллергенами является ключом к развитию воспалительных заболеваний, целью этого исследования является оценка противовоспалительного потенциала каннабидиола (CBD) в этой ситуации. У 8-недельных крыс Вистар астма индуцировалась овальбумином (OVA). В последние 2 дня заражения OVA животные получали КБД (5 мг / кг, внутрибрюшинно) и были убиты через 24 часа. Уровни IL-4, IL-5, IL-13, IL-6, IL-10 и TNF-α определялись в сыворотке крови. Лечение КБД позволило снизить сывороточные уровни всех анализируемых цитокинов, за исключением уровней IL-10. КБД, по-видимому, является потенциальным новым лекарственным средством для модуляции воспалительного ответа при астме.

Вступление

В последние десятилетия распространенность атопических заболеваний, включая дерматит и астму, которые имеют общие генетические и экологические факторы риска, увеличилась, и в настоящее время она поражает примерно 20% населения в развитых странах [1, 2].

Астма - это расстройство проводящих дыхательных путей, которые слишком много и слишком легко сокращаются как спонтанно, так и в ответ на широкий спектр экзогенных и эндогенных раздражителей. Эта гиперреактивность дыхательных путей сопровождается повышенной сенсорной раздражительностью дыхательных путей и повышенной секрецией слизи. Различные клинические проявления астмы включают различные факторы окружающей среды, которые взаимодействуют с дыхательными путями, вызывая острое и хроническое воспаление. Несколько других факторов способствуют этому явлению, включая сокращение гладких мышц, отек и ремоделирование дыхательных путей. Неоднородность астмы также может быть связана с различным ответом на лечение [3].

Классически астма характеризуется хроническим воспалением и ремоделированием дыхательных путей, гиперреактивностью и увеличением цитокинов, связанных с уровнем Т-хелперов 2 (Th2-) [3]. Чтобы противодействовать этому ответу, несколько иммуномодулирующих стратегий были протестированы как в доклинических, так и в клинических условиях. Каннабиноиды являются компонентами растения Cannabis (марихуана) и, как известно, оказывают сильное противовоспалительное, иммуномодулирующее и обезболивающее действие посредством активации рецепторов каннабиноидов-1 и каннабиноидов-2 (CB1 и CB2), расположенных в центральной нервной системе (ЦНС) и в эндокринных органах соответственно [4]. Недавно ревизия Бурштейна показала участие КБД в контроле воспалительного ответа, экспрессии и генетической транскрипции, а также сохранила функциональные эффекты при различных заболеваниях (колите, сепсис-энцефаломиелите и воспалительных заболеваниях легких) [5]. Также было продемонстрировано, что CBD хорошо переносится без значительных эффектов даже при хроническом введении людям [6]. Лечение астмы остается проблематичным и часто включает в себя комбинацию лекарств, включая кортикостероиды, бронходилататоры, модификаторы лейкотриена, а в последнее время - целенаправленную терапию, такую как анти-IgE и антицитокины. Все эти методы лечения имеют свои сильные и слабые стороны. Кроме того, пациенты с неконтролируемой или частично контролируемой астмой, несмотря на интенсивное лечение, все равно в той или иной степени страдают от своего заболевания. Таким образом, существует явная необходимость в изучении новых способов лечения этого респираторного заболевания [7].

Два наиболее важных каннабиноида, 9-тетрагидроканнабинол (9-ТГК) и каннабидиол (CBD), были выделены и синтезированы в середине 1960-х годов. КБД является основным непсихотропным каннабиноидом, и было показано, что он оказывает благотворное влияние при многих патологических состояниях, включая нервно-психические расстройства [8] и воспалительные заболевания головного мозга, не обладая значительной активностью в отношении рецепторов CB1 и CB2. Из-за его положительного влияния на течение некоторых заболеваний и низкой токсичности для людей [9], CBD является многообещающим кандидатом для лечения астмы. В связи с этим настоящее исследование было разработано для оценки влияния каннабидиола на параметры воспаления (оцениваемые по уровням цитокинов) у крыс, подвергнутых модели астмы.

Материалы и методы

Животные

Взрослых самцов крыс линии Вистар (8 недель) получали из племенной колонии UNESC (Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, Brazil). Их содержали по пять в каждой клетке с едой и водой, доступными ad libitum, и содержали 12-часовой цикл свет / темнота (свет включался в 7:00 утра). Все экспериментальные процедуры с участием животных выполнялись в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных, с одобрения комитета по этике от Universidade do Extremo Sul Catarinense.

Дизайн исследования и лечение

Крысы были иммунизированы внутрибрюшинно, инъекция 10 мкг куриного овальбумина (OVA) в 100 мкл гидроксида алюминия (квасцов) или только квасцов. Через 14 дней крысам вводили OVA или квасцы. Семь дней спустя крысам давали аэрозольные пробы (30 мин / в течение 3 дней) с 1% OVA или физиологическим раствором.

КБД (THC Pharm, Франкфурт, Германия, и STI Pharm, Великобритания) суспендировали в 2% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата (Твин 80). Растворы готовились непосредственно перед использованием и были защищены от света во время экспериментальной сессии. КБД вводили внутрибрюшинно один раз в день в течение последних двух дней введения ОВА в дозе 5 мг / кг [10]. Все процедуры проводились в объеме 1 мл / кг CBD или носителя. Для этого эксперимента использовали 21 крысу, которые были случайным образом разделены на три группы: носитель (контроль) (n=7), OVA + носитель (контроль астмы) (n=7) и OVA + CBD (астма + лечение) (n=7). Образцы крови получали через 24 часа после последнего заражения путем декапитации для определения уровня цитокинов.

Анализ сывороточных цитокинов

Сывороточные интерлейкины IL-4, IL-5, IL-13, IL-6 и IL-10 и TNF-α анализировали по технологии Luminex xMap. Вкратце, специфические антитела для каждого цитокина были иммобилизованы в микросферах через ковалентные связи. После того, как аналитическая проба связывается с захватывающими антителами, расположенными на поверхности микросфер, обнаружение конца осуществляется с помощью третьего флуоресцентного маркера, фикоэритрина, связанного с антителом для обнаружения. Конечным результатом является тест через микросферы. Цитокины выражали в пг / мл сыворотки.

Статистический анализ

Все данные были представлены как среднее ± SEM. Статистические сравнения между экспериментальными группами используют односторонний анализ ANOVA и специальные тесты Ньюмена-Кеулса. Все статистические анализы были выполнены с SPSS 17,0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс). Различия считались значительными, когда p<0,05.

Результаты

Мы определили уровни 6 цитокинов, связанных с астмой, которые можно разделить на профили ответа Th1 (TNF-α и IL-6) и Th2 (IL-4, IL-13, IL-10 и IL-5). Индукция астмы приводила к увеличению всех уровней цитокинов (рис. 1 и 2) по сравнению с контрольными животными. Лечение КБД позволило уменьшить как Th1, так и Th2 цитокины (Рисунки 1 и 2).

Купить масло КБД

Рисунок 1. Влияние каннабидиола на уровень цитокинов профиля Th1 (а) уровни TNF-α (б) уровни IL-6. Столбцы представляют собой среднее значение ± SD для 7 крыс.

масло КБДкупить КБД в России

Рисунок 2. Влияние каннабидиола на уровень цитокинов профиля Th2 (а) уровни IL-4 (б) уровни IL-5 (c) уровни IL-10 (d) уровни IL-13. Столбцы представляют собой среднее значение ± SD для 7 крыс.

Обсуждение

В этом исследовании демонстрируется защитное действие КБД на воспалительную реакцию в модели астмы на животных; оба ответа Th1 и Th2 притупляются лечением каннабидиолом.

Это открытие согласуется с недавним исследованием, в котором было показано, что CBD обладает мощными иммуносупрессивными и противовоспалительными свойствами. Таким образом, мы задаемся вопросом, будет ли КБД эффективным в контроле воспаления на мышиной модели астмы, как сообщалось в других моделях воспаления [11]. Защитные эффекты CBD при воспалении легких были продемонстрированы на нескольких различных моделях. Рибейро и его коллеги показали, что лечение КБД на модели острого повреждения легких, вызванного липополисахаридом (LPS), снижает общую сопротивляемость легких и эластичность и улучшает некоторые маркеры воспаления [12]. Однако воспаление, связанное с астмой, несколько отличается от наблюдаемого на этих моделях. Крысы сенсибилизируются большим количеством антигенов, которые обычно не подвергаются воздействию окружающей среды, включая OVA, которые могут вызывать реакции как Th1, так и Th2, что отличается от воспаления, вызванного LPS [13].

Лечение каннабидиолом значительно снижало уровни цитокинов, участвующих в иммунном ответе на аллерген, такой как IL-4 и IL-5. IL-4 отвечает за ингибирование дифференцировки клеток Th1 и за дифференцировку и размножение клеток Th2 и играет важную роль в выработке IgE. IL-4 был повышен у пациентов с атопической и неатопической астмой [14, 15]. Кроме того, IL-4, по-видимому, необходим для того, чтобы Т-лимфоциты продуцировали IL-5 [14–16]. IL-5 необходим для созревания эозинофилов и накапливается в легких во время воспалительного процесса при астме [17].

Гиперсекреция слизи является важной характеристикой астмы, которая способствует обострению симптомов. IL-13 считается основным стимулятором для этого явления [18]. Мы здесь демонстрируем, что IL-13 был уменьшен под воздействием CBD. IL-6 стимулирует пролиферацию Т-клеток, увеличивая выработку IgE в зависимости от IL-4. Уровни IL-6 повышаются в мокроте и системном кровообращении у пациентов с тяжелой формой астмы, что может быть причиной повышения циркуляции С-реактивного белка у этих пациентов [19]. КБД также способен снижать уровни IL-6 на животных моделях. TNF-α является основным медиатором тяжелой астмы, и было продемонстрировано, что растворимый TNFR и антитела против TNF-α [20, 21] эффективны на животных моделях астмы, а КБД снижает уровни TNF-α в нашей модели.

У людей было несколько попыток уменьшить воспалительный ответ при астме. Анти-интерлейкины-4 и анти-интерлейкины-5 были эффективными в снижении обострений и стойкой эозинофилии у пациентов с астмой [22]. Кроме того, анти-интерлейкины-9 и анти-интерлейкины-13 уменьшали симптомы, связанные с астмой [23, 24]. В этом контексте, поскольку CBD безопасно использовался на людях, можно предположить, что возможен быстрый переход к изучению его эффектов на людях.

До сих пор было мало известно об эффекторных клетках КБД в иммунной системе. Недавно Хедж и его коллеги дали несколько важных идей в этой области. Они продемонстрировали, что каннабидиол способен индуцировать миелоидные клетки-супрессоры, и эти клетки подавляют пролиферацию Т-клеток ex vivo. Кроме того, этот эффект зависел от секреции G-CSF тучными клетками [25]. Каннабидиол способен напрямую подавлять секрецию Т-клетками IL-2 и IFN-гамма [26]. Эти эффекты, по-видимому, согласуются с нашими результатами защитного действия на мышиной модели астмы.

Существуют некоторые ограничения в интерпретации настоящих данных. Во-первых, у нас нет прямых доказательств воспаления дыхательных путей, так как мы не можем определить влияние CBD на цитокины жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Во-вторых, мы не измеряем функцию легких; таким образом, мы не можем определить, влияет ли КБД на препятствие потоку воздуха в нашей модели. Несмотря на большую актуальность, мы считаем, что наши результаты имеют большое значение. Это первое доказательство положительного эффекта CBD в модели астмы на животных. Кроме того, мы измеряем несколько различных цитокинов, и все результаты согласуются со значительным противовоспалительным эффектом КБД.

В заключение, мы здесь демонстрируем, что введение КБД на животной модели астмы может ослабить реакцию цитокинов сыворотки на OVA у сенсибилизированных животных. Эти эффекты предполагают возможность нового лечения астмы, поскольку CBD контролирует преувеличенную воспалительную реакцию, наблюдаемую в этой модели.

  1. D. Laughter, J. A. Istvan, S. J. Tofte, and J. M. Hanifin, “The prevalence of atopic dermatitis in Oregon schoolchildren,” Journal of the American Academy of Dermatology, vol. 43, no. 4, pp. 649–655, 2000. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  2. J. Ker and T. V. Hartert, “The atopic march: what's the evidence?” Annals of Allergy, Asthma and Immunology, vol. 103, no. 4, pp. 282–289, 2009. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  3. S. T. Holgate, “Pathogenesis of asthma,” Clinical and Experimental Allergy, vol. 38, no. 6, pp. 872–897, 2008. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  4. J. M. Cunha, E. A. Carlini, A. E. Pereira et al., “Chronic administration of cannabidiol to healthy volunteers and epileptic patients,” Pharmacology, vol. 21, no. 3, pp. 175–185, 1980. View at Publisher ·View at Google Scholar · View at Scopus
  5. S. Burtein, “Cannabidiol (CBD) and its analogs: a review of their effects on inflammation,” Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol. 1, pp. 1377–1385, 2015. View at Google Scholar
  6. R. G. Pertwee, “The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and delta9-tetrahydrocannabivarin,” British Journal of Pharmacology, vol. 153, no. 2, pp. 199–215, 2008. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  7. K. F. Chung, “New treatments for severe treatment-resistant asthma: targeting the right patient,” The Lancet Respiratory Medicine, vol. 1, no. 8, pp. 639–652, 2013. View at Publisher · View at Google Scholar
  8. A. W. Zuardi, J. A. S. Crippa, J. E. C. Hallak, F. A. Moreira, and F. S. Guimarães, “Cannabidiol, a Cannabis sativa constituent, as an antipsychotic drug,” Brazilian Journal of Medical and Biological Research, vol. 39, no. 4, pp. 421–429, 2006. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  9. M. M. Bergamaschi, R. H. C. Queiroz, A. W. Zuardi, and J. A. S. Crippa, “Safety and side effects of cannabidiol, a Cannabis sativa constituent,” Current Drug Safety, vol. 6, no. 4, pp. 237–249, 2011. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  10. A. W. Zuardi, “Cannabidiol: from an inactive cannabinoid to a drug with wide spectrum of action,” Revista Brasileira de Psiquiatria, vol. 30, no. 3, pp. 271–280, 2008. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  11. R. Mechoulam, L. A. Parker, and R. Gallily, “Cannabidiol: an overview of some pharmacological aspects,” Journal of Clinical Pharmacology, vol. 42, no. 11, pp. 11S–19S, 2002. View at Google Scholar · View at Scopus
  12. A. Ribeiro, V. Ferraz-De-Paula, M. L. Pinheiro et al., “Cannabidiol, a non-psychotropic plant-derived cannabinoid, decreases inflammation in a murine model of acute lung injury: role for the adenosine A2Areceptor,” European Journal of Pharmacology, vol. 678, no. 1–3, pp. 78–85, 2012. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  13. A. T. Nials and S. Uddin, “Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge,” Disease Models and Mechanisms, vol. 1, no. 4-5, pp. 213–220, 2008. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  14. M. Humbert, S. R. Durham, S. Ying et al., “IL-4 and IL-5 mRNA and protein in bronchial biopsies from patients with atopic and nonatopic asthma: evidence against 'intrinsic' asthma being a distinct immunopathologic entity,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, vol. 154, no. 5, pp. 1497–1504, 1996. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  15. T. C. Kotsimbos, P. Ernst, and Q. A. Hamid, “Interleukin-13 and interleukin-4 are coexpressed in atopic asthma,” Proceedings of the Association of American Physicians, vol. 108, no. 5, pp. 368–373, 1996. View at Google Scholar · View at Scopus
  16. S. Ying, M. Humbert, J. Barkans et al., “Expression of IL-4 and IL-5 mRNA and protein product by CD4+and CD8+ T cells, eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics,” The Journal of Immunology, vol. 158, no. 7, pp. 3539–3544, 1997. View at Google Scholar · View at Scopus
  17. T. G. Uhm, B. S. Kim, and Y. S. Chung II, “Eosinophil development, regulation of eosinophil-specific genes, and role of eosinophils in the pathogenesis of asthma,” Allergy, Asthma and Immunology Research, vol. 4, no. 2, pp. 68–79, 2012. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  18. F. A. DiGiovanni, R. Ellis, J. Wattie, J. A. Hirota, D. S. Southam, and M. D. Inman, “Concurrent dual allergen exposure and its effects on airway hyperresponsiveness, inflammation and remodeling in mice,” DMM Disease Models and Mechanisms, vol. 2, no. 5-6, pp. 275–282, 2009. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  19. S. Wenzel, D. Wilbraham, R. Fuller, E. B. Getz, and M. Longphre, “Effect of an interleukin-4 variant on late phase asthmatic response to allergen challenge in asthmatic patients: results of two phase 2a studies,” The Lancet, vol. 370, no. 9596, pp. 1422–1431, 2007. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  20. J. van Snick, “Interleukin-6: an overview,” Annual Review of Immunology, vol. 8, pp. 253–278, 1990. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  21. S. C. Erzurum, “Inhibition of tumor necrosis factor α for refractory asthma,” The New England Journal of Medicine, vol. 354, no. 7, pp. 754–758, 2006. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  22. P. Flood-Page, C. Swenson, I. Faiferman et al., “A study to evaluate safety and efficacy of mepolizumab in patients with moderate persistent asthma,” The American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, vol. 176, no. 11, pp. 1062–1071, 2007. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  23. J. Corren, R. F. Lemanske Jr., N. A. Hanania et al., “Lebrikizumab treatment in adults with asthma,” The New England Journal of Medicine, vol. 365, no. 12, pp. 1088–1098, 2011. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus
  24. J. M. Parker, C. K. Oh, C. LaForce et al., “Safety profile and clinical activity of multiple subcutaneous doses of MEDI-528, a humanized anti-interleukin-9 monoclonal antibody, in two randomized phase 2a studies in subjects with asthma,” BMC Pulmonary Medicine, vol. 11, article 14, 2011. View at Publisher ·View at Google Scholar · View at Scopus
  25. V. L. Hegde, U. P. Singh, P. S. Nagarkatti, and M. Nagarkatti, “Critical role of mast cells and peroxisome proliferator-activated receptor γ in the induction of myeloid-derived suppressor cells by marijuana cannabidiol in vivo,” The Journal of Immunology, 2015. View at Publisher · View at Google Scholar
  26. B. L. F. Kaplan, A. E. B. Springs, and N. E. Kaminski, “The profile of immune modulation by cannabidiol (CBD) involves deregulation of nuclear factor of activated T cells (NFAT),” Biochemical Pharmacology, vol. 76, no. 6, pp. 726–737, 2008. View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus

Оригинальная версия статьи